{"id":8039,"date":"2021-08-23T15:11:28","date_gmt":"2021-08-23T15:11:28","guid":{"rendered":"https:\/\/sites.unimi.it\/demone\/?page_id=8039"},"modified":"2021-10-01T11:17:22","modified_gmt":"2021-10-01T11:17:22","slug":"malattia","status":"publish","type":"page","link":"https:\/\/sites.unimi.it\/demone\/progetto\/malattia\/","title":{"rendered":"Malattia"},"content":{"rendered":"

MALATTIA<\/strong><\/span><\/h2>\n<\/div><\/div>
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L\u2019agente eziologico<\/strong><\/p>\n

La neosporosi \u00e8 provocata da Neospora caninum<\/em>, un protozoo parassita appartenente al Phylum Apicomplexa, che comprende tutti i protozoi provvisti di complesso apicale, alla Classe Sporozoasida, all\u2019Ordine Eucoccidionida e alla Famiglia Sarcocystidae.<\/p>\n

N.caninum<\/em> ha la propriet\u00e0 di formare cisti nei tessuti dell\u2019ospite che infetta mediante uno dei 3 principali stadi che si conoscono:<\/p>\n

– I tachizoiti di forma allungata (6×2 \u03bcm), che rappresentano la forma invasiva del parassita a replicazione rapida e che si moltiplicano nel citoplasma cellulare.<\/p>\n

– I bradizoiti contenuti nelle cisti tissutali, ovvero la forma di resistenza parassitaria a replicazione lenta, che si sviluppa nell\u2019ospite intermedio. Le cisti si trovano principalmente a livello del tessuto nervoso, sono di forma allungata o rotondeggiante e hanno una parete spessa (4\u03bcm).<\/p>\n

– Gli sporozoiti contenuti nelle oocisti, ovvero la forma di resistenza parassitaria nell\u2019ambiente esterno. Le oocisti hanno una forma rotondeggiante, misurano circa 10×12 \u03bcm e vengono emesse dall\u2019ospite definitivo. Nell\u2019ambiente esterno\u00a0diventano infettanti poich\u00e9 si formano gli sporozoiti\u00a0dopo circa 24 ore dall\u2019emissione nelle feci (sporulazione).<\/p>\n<\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/section>

\u00a0<\/strong>Ciclo biologico<\/strong><\/p>\n

N.caninum<\/em> si diffonde nelle popolazioni animali sensibili infettando gli ospiti che possono essere distinti in due categorie, ospiti definitivi e ospiti intermedi a seconda della loro funzione. Gli ospiti definitivi, in cui il parassita svolge la parte intestinale del ciclo, sono il cane (Canis lupus familiaris<\/em>) e altri canidi selvatici: il lupo (Canis lupus lupus<\/em>), il dingo (Canis lupus dingo<\/em>) e il coyote (Canis latrans<\/em>). Gli ospiti intermedi, in cui il parassita svolge solo la parte extra-intestinale del ciclo, sono numerosi mammiferi domestici e selvatici: il bovino (Bos taurus<\/em>), la pecora (Ovis aries<\/em>), la capra (Capra<\/em> hircus<\/em>), il cervo (Cervus elaphus<\/em>), il cavallo (Equus ferus caballus<\/em>), il bufalo (Bubalus<\/em> bubalis<\/em>) e il cane stesso. Il cane si infetta mediante l\u2019ingestione di tessuti e\/o organi contenenti cisti tissutali, come feti abortiti e invogli fetali: se in allevamento il cane ha liberamente accesso alle sale parto e alle aree di ricovero degli animali e tali visceri non vengono opportunamente smaltiti, l\u2019infezione \u00e8 facilitata. Nel cane, l\u2019infezione per via orale determina lo sviluppo del parassita primariamente a livello della mucosa intestinale (tenue) che culmina con la produzione delle oocisti che andranno a contaminare l\u2019ambiente in cui il cane vive o in cui si sposta.<\/p>\n

Nel cane \u00e8 riconosciuta anche una via di trasmissione transplacentare, soprattutto nel caso di cagne infette cronicamente.
\nI cani sono ospiti completi, infatti, oltre a essere ospiti definitivi nel ciclo di N. caninum <\/em>emettendo oocisti da 8 a 23 giorni dopo l\u2019infezione, possono anche essere ospiti intermedi, albergando cisti tissutali a livello cerebrale.<\/p>\n<\/div><\/div>

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Gli ospiti intermedi, tra cui i principali sono i bovini, consentono al parassita di svolgere nel loro organismo solo la parte extra-intestinale del ciclo del parassita e si infettano mediante due principali vie di trasmissione:<\/p>\n

– La via orizzontale<\/strong>, attraverso l\u2019ingestione di alimenti o acqua contaminati da oocisti infettanti, ovvero che sono andate incontro a sporulazione dopo l\u2019emissione da parte dell\u2019ospite definitivo, il cane.<\/p>\n

– La via verticale<\/strong>, responsabile del mantenimento dell\u2019infezione all\u2019interno degli allevamenti, mediante il passaggio transplacentare dei tachizoiti al feto.<\/p>\n

Nella via verticale distinguiamo una trasmissione esogena<\/strong> e una endogena<\/strong>.<\/p>\n

La trasmissione esogena avviene quando l\u2019animale gravido contrae l\u2019infezione durante il periodo di gestazione, mediante l\u2019ingestione di oocisti sporulate presenti in ambiente; mentre quella endogena, si ha quando si assiste ad una riattivazione di un\u2019infezione cronica (a sua volta contratta per via orizzontale o congenita) a seguito della replicazione rapida di tachizoiti presenti nelle cisti del tessuto nervoso.<\/p>\n<\/div><\/div><\/div><\/div><\/div>

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Foto 1: Ciclo biologico di Neospora caninum (tratto da Dubey et al., 2017)<\/em><\/p>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/section>

Epidemiologia<\/strong><\/p>\n

La neosporosi \u00e8 una malattia parassitaria molto diffusa negli allevamenti di bovini da latte che causa importanti ripercussioni sulla efficienza\u00a0 riproduttiva degli animali.
\nLa movimentazione e lo scambio di animali su tutto il territorio europeo, senza l\u2019esecuzione di test sierologici in ingresso e di periodi di quarantena, ha favorito la diffusione di questa patologia anche negli allevamenti italiani.
\nIn Italia, non essendo presenti piani di controllo ufficiali, i dati epidemiologici si deducono dalle analisi effettuate da laboratori, con ampie variabilit\u00e0 dovute ai metodi dia\u00adgnostici utilizzati, al tipo di allevamento, alla valutazione condotta a livello individuale o aziendale.<\/p>\n

Al Nord Italia si stima una sieroprevalenza media di 20% e circa il 50% degli allevamenti registra almeno un capo positivo all\u2019indagine sierologica (Otranto et al<\/em>., 2003); al Sud la sieroprevalenza \u00e8 leggermente inferiore, fatta eccezione per la Sardegna, dove nelle aziende di bovini da latte si registrano valori medi di 55% (Varcasia et al<\/em>., 2006; Otranto et al<\/em>., 2003). Inoltre, \u00a0un recente studio condotto in Lombardia su feti abortiti di bovine da latte di razza Frisona ha rilevato, mediante real-time PCR (Polymerase Chain Reaction<\/em>), una positivit\u00e0 molecolare pari al 27,8% (Villa et al<\/em>., 2021).<\/p>\n

Neospora caninum<\/em> \u00e8 uno dei principali agenti di aborto infettivo nel bovino e dal punto di vista epidemiologico possiamo distinguere differenti situazioni di circolazione del patogeno in allevamento:<\/p>\n

– Una forma abortigena di tipo sporadico con un tasso annuale di aborti inferiore al 3%.<\/p>\n

– Una forma endemica: si osserva un tasso di aborti, soprattutto dovuti all\u2019infezione per via transplacentare endogena, costante nel tempo e che pu\u00f2 arrivare fino al 10%.<\/p>\n

– Una forma epidemica per trasmissione orizzontale: in breve tempo arriva a interessare fino al 30% delle bovine gravide con la comparsa simultanea o in rapida successione di aborti, la cosiddetta \u201ctempesta di aborti\u201d.<\/p>\n

Nel caso di N. caninum<\/em>, le bovine che hanno gi\u00e0 abortito possono abortire nuovamente nelle gravidanze successive. Infatti, \u00e8 stato dimostrato che all\u2019aumentare della sieropositivit\u00e0 aumenta il rischio di aborto: le bovine sieropositive presentano un rischio di aborto da 2 a 12 volte superiore rispetto alle bovine sieronegative. Oltre a ci\u00f2, si stima che fino al 95% dei vitelli nati da madri positive siano infetti per via congenita, anche senza presentare una evidente sintomatologia clinica.<\/p>\n

Impatto economico<\/strong><\/p>\n

La perdita economica dovuta alla neosporosi \u00e8 causata soprattutto dai problemi riproduttivi a seguito dell\u2019infezione. In particolar modo, il forte impatto economico \u00e8 legato all\u2019aumento del numero di inseminazioni necessarie per fecondare le vacche, e quindi alla presenza di \u201crepeat breeders\u201d in allevamento, all\u2019allungamento dell\u2019intervallo inter-parto e di quello parto-concepimento e alla perdita della produzione lattea a seguito del fenomeno abortivo.
\nA livello mondiale si stimano perdite medie che vanno dai 600 milioni a 2 miliardi di dollari all\u2019anno, di cui i due terzi negli allevamenti da latte e un terzo in quelli da carne. Il principale motivo per cui negli allevamenti da latte le perdite sono maggiori \u00e8 che il costo di un aborto comprende, non solo la perdita del vitello, ma anche la perdita della produzione di una lattazione (Reichel et al<\/em>.,2013).<\/p>\n<\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/section>

Patologia<\/strong><\/p>\n

Neospora caninum<\/em> \u00e8 una delle principali e pi\u00f9 importanti cause di aborto infettivo nel bovino. Le bovine possono abortire in qualsiasi momento della gestazione, ma la maggior parte degli aborti avviene nell\u2019intervallo temporale compreso fra il terzo e il settimo mese di gravidanza.
\nSe l\u2019aborto cade nel primo terzo di gravidanza si assiste al riassorbimento dell\u2019embrione e al ritorno in calore della bovina, nel secondo terzo di gravidanza si ha la mummificazione fetale con conseguente aborto oppure la nascita di animali disvitali e sintomatici, mentre nell\u2019ultimo terzo di gravidanza si osserva la nascita di vitelli infetti ma asintomatici. Quest\u2019ultima evenienza rappresenta la principale causa del mantenimento dell\u2019infezione in azienda, in quanto le vitelle nate, che costituiranno la rimonta interna dell\u2019allevamento, non presentano alcun segno clinico fino al momento dell\u2019aborto e del ritorno in calore.
\nNei vitelli che nascono infetti e sintomatici i segni clinici rilevabili sono atassia, esoftalmo, debolezza e iperestensione degli arti. Le lesioni istologiche sono caratterizzate da segni di encefalomielite non suppurativa.
\nNelle bovine adulte, l\u2019unico segno clinico \u00e8 l\u2019aborto e il conseguente ritorno in calore.
\nNegli ospiti definitivi, ovvero i cani, normalmente non si osservano segni clinici. Nel caso di cuccioli infettati per via transplacentare si pu\u00f2 assistere ad una grave forma clinica con lo sviluppo di una paralisi ascendente progressiva a partire dagli arti posteriori. Le lesioni istologiche sono caratterizzate da focolai di infiammazione suppurativa e granulomatosa.<\/p>\n

Diagnosi nel bovino<\/strong><\/p>\n

Per la diagnosi di neosporosi nel bovino possiamo utilizzare metodi diretti per la ricerca del parassita o indiretti per la ricerca degli anticorpi.
\nPer procedere correttamente occorre valutare i dati epidemiologici e la storia clinica dell\u2019animale.<\/p>\n

Metodi diretti<\/strong><\/p>\n

La diagnosi diretta per la ricerca di Neospora caninum<\/em> pu\u00f2 essere effettuata mediante tecniche immunoistochimiche o mediante tecniche molecolari.<\/p>\n

– In passato la principale tecnica diretta utilizzata era l\u2019immunoistochimica (IHC) su tessuti e organi fetali. Questa metodica \u00e8 molto specifica ma non \u00e8 in grado di rilevare il parassita se vi \u00e8 autolisi dei tessuti.<\/p>\n

– Ad oggi, la principale metodica diretta utilizzata per la sua alta sensibilit\u00e0 e specificit\u00e0 \u00e8 la PCR (Polymerase Chain Reaction<\/em>).
\nLa PCR consente, infatti, di amplificare in poco tempo il DNA partendo da quantit\u00e0 minime di materiale iniziale.
\nDopo l\u2019estrazione del DNA, si amplificano regioni target del parassita, tra cui la regione ITS1 e il gene Nc5, attraverso tecniche sia end-point che real-time.
\n\u00c8 importante sottolineare che la sola rilevazione del protozoo non sempre rappresenta la prima causa di aborto, infatti la certezza viene raggiunta mediante l\u2019evidenziazione delle caratteristiche lesioni cerebrali e l\u2019associazione della positivit\u00e0 molecolare nel feto con quella sierologica nella vacca abortente.<\/p>\n<\/div><\/div>

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Metodi indiretti<\/strong><\/p>\n

L\u2019esposizione all\u2019infezione si evidenzia per via indiretta ricercando gli anticorpi prodotti dall\u2019animale durante l\u2019infezione, utilizzando differenti metodiche sierologiche.<\/p>\n

– La tecnica IFAT (Immunofluorescence antibody test<\/em>) \u00e8 stata la prima metodica sierologica utilizzata per diagnosticare la neosporosi nel bovino. I tachizoiti di Neospora caninum<\/em> fissati su vetrino sono incubati con il siero in esame, si aggiungono gli anticorpi secondari specie-specifici coniugati con un fluorocromo e si leggono i vetrini al microscopio a fluorescenza.
\nIl principale vantaggio di questo test \u00e8 che consente di ottenere un titolo anticorpale e proprio per questo, spesso, viene utilizzato come esame di conferma in caso di risultati dubbi ottenuti con altre tecniche.
\nIl limite maggiore di questa tecnica \u00e8 che, essendo molto laboriosa, richiede un personale altamente qualificato. Oltre a ci\u00f2, i risultati ottenuti sono spesso operatore-dipendenti in quanto sottoposti a una interpretazione soggettiva.<\/p>\n<\/div><\/div><\/div><\/div><\/div>

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Foto 2: Ingrandimento al microscopio a fluorescenza, in verde si evidenziano i tachizoiti di Neospora caninum<\/em><\/p>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/div>

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– La tecnica ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay<\/em>), che include l\u2019antigene o l\u2019anticorpo di fase solida, l\u2019antigene o l\u2019anticorpo marcato con l\u2019enzima e il substrato della reazione enzimatica.
\nIn commercio sono disponibili diversi kit ELISA commerciali, tra cui uno di tipo competitivo. I vantaggi i questa metodica sono il basso costo, la semplicit\u00e0 di esecuzione e la lettura oggettiva dei risultati ottenuti.
\nGli svantaggi sono che sono stati segnalati fenomeni di cross-reattivit\u00e0 con altri protozoi appartenenti alla famiglia Sarcocystidae, quali Toxoplasma gondii<\/em>, Besnoitia besnoiti<\/em> e Sarcocystis <\/em>spp., e che non si ottiene un titolo anticorpale definito, il che rende necessario l\u2019utilizzo di un altro test diagnostico per quantificare gli anticorpi prodotti dall\u2019animale.
\nUna ulteriore possibilit\u00e0 diagnostica \u00e8 offerta dall\u2019Avidity ELISA , che \u00e8 in grado di differenziare le infezioni acute da quelle croniche.
\nOltre all\u2019esame su siero, i test ELISA sono progettati anche per utilizzare come matrice il latte, individuale o di massa.<\/p>\n<\/div><\/div><\/div><\/div><\/div>

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Foto 3: Piastra ELISA, in giallo si evidenziano i pozzetti positivi<\/em><\/p>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/div>

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In questo caso, i principali svantaggi sono che gli anticorpi nel latte compaiono pi\u00f9 tardivamente, sono circa 30 volte meno concentrati e si calcola che all\u2019interno del pool di latte debbano essere presenti almeno 10-15% di animali sieropositivi affinch\u00e9 il campione di latte risulti positivo.
\nIl latte di massa costituisce comunque un campione facile da prelevare e l\u2019analisi \u00e8 poco costosa, pertanto un\u2019indagine di questo tipo pu\u00f2 essere utile a livello di screening di massa all\u2019interno dell\u2019allevamento.<\/p>\n

– Il Western Blot (WB), che \u00e8 la metodica sierologica pi\u00f9 utilizzata come test di conferma dei risultati positivi ottenuti con le precedenti tecniche.
\nNel WB gli anticorpi eventualmente presenti nei sieri da esaminare reagiscono con le proteine di N.caninum<\/em> precedentemente separate mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide (SDS-PAGE) e, in seguito, trasferite su una membrana di nitrocellulosa. I limiti maggiori di questa tecnica sono il richiedere molto tempo per l\u2019esecuzione e un personale altamente qualificato.
\nConsiderando che gli anticorpi anti-N. caninum<\/em> subiscono fluttuazioni durante il periodo di gravidanza, \u00e8 consigliato testare gli animali nella seconda met\u00e0 della gestazione, quando i titoli anticorpali raggiungono il picco.<\/p>\n<\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/div><\/section>

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Diagnosi nel cane<\/strong><\/p>\n

Anche nell\u2019ospite definitivo del ciclo parassitario, ovvero il cane, possiamo distinguere metodi diagnostici diretti e indiretti.<\/p>\n

– Il principale metodo di diagnosi diretta \u00e8 l\u2019esame copromicroscopico delle feci per arricchimento (flottazione) con l\u2019utilizzo della soluzione sodio cloruro (NaCl), per verificare l\u2019escrezione delle oocisti di N. caninum <\/em>.
\nUn eventuale esito positivo richiede una conferma molecolare in quanto le oocisti sono indistinguibili da quelle di un altro protozoo appartenente alla famiglia Sarcocystidae, ovvero, Hammondia heydorni<\/em>.
\nI principali limiti dei metodi diretti sono che solo in pochi casi sono state osservate al microscopio oocisti emesse da feci di animali naturalmente infetti e che la frequenza e durata dell\u2019escrezione delle oocisti, ad oggi, non \u00e8 nota.<\/p>\n

– I principali metodi di diagnosi indiretta nel cane sono la tecnica IFAT e la tecnica ELISA, come nel bovino.<\/p>\n

Controllo<\/strong><\/p>\n

Nonostante la grande diffusione della neosporosi negli allevamenti di bovini da latte, questa malattia non \u00e8 regolamentata n\u00e9 a livello nazionale n\u00e9 europeo: i piani di controllo adottati all\u2019interno dei diversi Stati sono unicamente di tipo volontario. Oltre a ci\u00f2, ad oggi, non esistono in commercio n\u00e9 vaccini n\u00e9 trattamenti efficaci per contrastare l\u2019infezione da N. caninum<\/em>. Sono stati ottenuti buoni risultati con l\u2019utilizzo di toltrazuril nel bovino e di trimethoprim nel cane, ma sono necessari ulteriori studi.
\nI principali mezzi di controllo sono quelli diretti, che hanno come obiettivo la riduzione della sieroprevalenza aziendale e, quindi, del tasso di aborti annuale.<\/p>\n